10倍配资公司科学家首次实现修正线粒体DNA突变，治愈不治之症打开新大门

治愈不治之症10倍配资公司，又被向前推进了一公里：直接修改基因的那种。

发表在《PLOS Biology》（生物学 top 期刊）的最新研究显示，荷兰科学家成功纠正了线粒体 DNA 中的突变，在基因治疗领域取得重大突破。

我们知道，线粒体基因突变会导致其功能障碍，进而引发与衰老相关的疾病、某些类型的癌症以及严重且可能致命的母系遗传线粒体疾病。

尽管 CRISPR/Cas 技术的开发为核 DNA 编码的突变带来了革命性的可能性，但该系统无法有效穿过线粒体膜并到达线粒体 DNA，导致患有线粒体疾病的患者没有治疗的选择。

而DdCBE（双链 DNA 脱氨酶衍生的胞嘧啶碱基编辑器）解决了这个问题，能够通过一种不依赖 CRISPR/Cas 的系统在线粒体基因组中进行编辑，精确改变线粒体 DNA 中的错误遗传字母，无需切割 DNA 链。

该研究让一些饱受疾病困扰的网友看到了治愈的希望。

在原代成人细胞中有效恢复线粒体功能

为探索 DdCBE 介导的线粒体 DNA 基因编辑的临床应用潜力，论文的研究团队在相关细胞类型中构建并功能校正了致病突变。

通过在人类成体肝脏类器官中引入致病性 m.15150G>A 突变，观察到其对 ATP 生成的显著影响；在 Gitelman 样综合征患者来源的成纤维细胞中成功校正 m.4291T>C 突变，可改善线粒体功能。

为推进 DdCBE 的临床转化，研究团队采用目前最先进的非病毒基因递送系统——脂质纳米颗粒（LNPs）实现了修饰 RNA（modRNA）编码的线粒体碱基编辑器高效递送。

该研究证实，DdCBE 能在原代成人细胞中有效恢复线粒体功能。

在患者来源的类器官中构建 m.15150G>A 突变

在人类原代成人体肝干细胞来源的类器官中引入致病性线粒体突变，以 MT-CYB 基因中的 m.15150G>A 突变为例，这个无义突变可能会完全丧失细胞色素 B 蛋白的功能。

为了精确靶向 DdCBE 至 m.15150G，研究团队设计了两组左端和右端 TALEs，如下图。

在 HEK293T 细胞中对所有四种左 / 右构建组合的验证表明，每种组合在 m.15150 处的 G → A 编辑效率都很高。

编辑特异性由靶向编辑与旁观者编辑的比率定义，结果表明使用 R2 构建组合的比率更高。

这些结果表明 L1R2 和 L2R2 是最佳组合，尽管效率更高的 m.15150G>A 无义突变可能掩盖了下游旁观者编辑的任何功能效应，因为 m.15154C>T 是一个沉默突变，而 m.15155C>T 是另一个无义突变。

出于一致性和旁观者编辑可能效果较差的原因，研究团队在进一步分析中继续使用 L1R1。

用 L1R1 编辑的 HEK293T 细胞中进行细胞色素 B 的 Western blot，结果显示细胞色素 B 蛋白水平降低。

随后，研究团队建立了一种通过电穿孔和 FACS（流式细胞分选）共转染 GFP 来选择转染的类器官细胞的线粒体编辑方案。

将电穿孔设备应用于类器官后，m.15150G>A 的平均编辑效率为43%。

由于每个细胞含有数百到数千个 mtDNA 分子，因此编辑效率可能在单个细胞之间有显著差异。为了解决这个问题，研究团队采用单细胞方法来阐明 DdCBE 效率的内在变异性。

对单次 FACS 分选的类器官细胞衍生的克隆类器官进行测序显示，编辑效率范围在 0% 到 80%。

两次实验的平均变异系数（VMR）为 5.96，表明存在相对较高的离散度。

这些结果表明，DdCBE 和类器官系的克隆生长可能是研究异质性对疾病机制影响的有用工具。

在患者来源的成纤维细胞中校正 m.4291T>C 突变

为了研究在原代细胞中纠正线粒体突变是否能恢复线粒体活性，研究团队选择了 m.4291T>C 突变。

该变异位于编码线粒体异亮氨酸 tRNA 的 MT-TI 基因中，并影响反密码子上游高度保守的尿嘧啶。

同样的，研究团队设计了两组左、右 TALEs 来引导 DdCBE 至 m.4291C，并在 L2 中引入一个不匹配但优选的胸腺嘧啶末端重复可变二肽（RVD）。

用器官样电穿孔方案处理成纤维细胞，并在 FACS 后以批量或单细胞方式接种细胞。

在同质化人类皮肤成纤维细胞上测试四种 DNA 构建体组合后发现，L2R2 组合是恢复 MT-TI 突变的最高效编辑器。

为了比较单个成纤维细胞之间的基因校正效率，研究团队从单个转染的成纤维细胞中衍生出克隆系，揭示了单个成纤维细胞之间编辑效率的显著差异。

与肝类器官类似，皮肤成纤维细胞的编辑效率离散度相当大（平均 VMR：6.8）。

为了评估编辑后的 mtDNA 在细胞 mtDNA 库中的稳定性，研究团队在培养超过 50 天后对编辑后的成纤维细胞（包括克隆和大量细胞系）进行测序。

有趣的是，在大多数成纤维细胞系中，m.4291T 编辑的分数随时间增加，这反映了编辑后的 mtDNA 没有选择劣势。

另外，线粒体 tRNA 基因（如 MT-TI）的突变已被报道会降低线粒体膜电位。因此，纠正 m.4291T>C 突变有望提高患者来源成纤维细胞的膜电位。

研究团队使用图像流式细胞术，分析了该突变在异质性水平背景下的功能效应。

TMRM 染色检测显示，在突变校正率达 76% 和 81% 的成纤维细胞中，线粒体膜电位确实得到改善；而校正率仅为 35% 的细胞则未观察到这一效应。

为进一步探究基因校正后线粒体的功能变化，研究团队采用 Seahorse 能量代谢分析系统进行检测。

结果显示：在葡萄糖培养基中，校正后的成纤维细胞表现出基础耗氧率（OCR）和 ATP 生成的适度提升；但在强制细胞依赖线粒体呼吸的半乳糖培养基中，这种改善并未出现。

然而，这些功能改善在不同实验批次间未能保持一致性。

尽管 m.4291T>C 突变的校正恢复了线粒体膜电位，但 OCR 的功能改善并不稳定，这表明在经校正的患者成纤维细胞中，线粒体功能恢复最多也只是适度水平。

基于 modRNA 和 LNPs 的线粒体碱基编辑

有效且安全的递送方法对于 DdCBE 的治疗应用至关重要。以 modRNA 形式包裹在 LNPs 中的、基于 CRISPR 的编辑工具，已经成功应用于多种体内模型。

为此，研究团队将靶向 m.15150G 和 m.4291C 的 DdCBE 构建体制备为 modRNA，以探究 LNP 递送 DdCBE modRNA 在原代患者来源细胞中编辑 mtDNA 的潜力。

研究 modRNA 在类器官中用于 m.15150G>A 编辑的效果，与 GFP 构建体共转染显示，modRNA 的转染效率比 DNA 质粒高 17 倍。

即使在通过 GFP-FACS 筛选转染细胞后，转染后第 6 天，modRNA 转染类器官的 mtBE 效率在常规或双倍剂量下仍比 DNA 转染类器官高约 4 倍（图 3B）。

为研究使用 modRNA 对细胞死亡的影响，研究团队通过电穿孔在 DNA 和 RNA 转染后监测细胞 7 天。

结果显示，DNA 转染导致类器官的细胞死亡比 modRNA 转染或无核苷酸对照至少高 3 倍，持续至少 4 天。

研究团队还研究了 modRNA 在患者来源成纤维细胞中的校正效果，结果表明，转染效率从 DNA 的 13.1% 提高到编码 DdCBE 蛋白和 GFP 的 modRNA 的96.6%。

使用 modRNA 时，m.4291T>C 校正的平均效率为 59%。

这些结果表明，modRNA 作为一种体外递送工具，具有极大的潜力，能够在保持活性的同时实现高效率。这对于难以维持和转染的细胞可能特别有前景。

为验证 DdCBE 与 LNPs 递送系统的兼容性，研究团队将靶向 m.4291T>C 的 modRNA 编码 DdCBE 编辑系统与 GFP-modRNA 共同封装于 LNPs 中。

用该制剂处理 m.4291T>C 突变成纤维细胞 3 天后，流式细胞检测显示：无论是单独 L2 组件还是 L2R2 复合组件，其转染效率均超过 90%。

该递送效率与商品化转染试剂介导的 modRNA 脂质体转染相当。

尤为关键的是，向 12500 个原代患者来源成纤维细胞递送 1 µ g LNP 包裹的 modRNA-DdCBE，可实现平均 28% 的编辑效率，充分展现了该技术在治疗性基因编辑中的应用潜力。

经校正患者成纤维细胞的脱靶编辑分析

研究团队还对基因校正后的成纤维细胞进行了脱靶编辑分析。

基于 L2 和 R2-TALE 靶序列的同源性，研究团队筛选了核基因组中 9 个潜在的脱靶位点。通过 NGS 扩增子测序发现，这些位点间隔区内存在少量 C • G → T • A 碱基替换（最高占测序读数的 0.2%）。

然而，在三组独立重复实验中，这些替换在基因编辑组中的丰度均未显著高于未校正的 L2-only 对照组，表明 DdCBE-m.4291-L2R2 碱基编辑器至少在这 9 个高同源性脱靶位点未产生显著编辑活性。

进一步在线粒体基因组靶向扩增区内（超出间隔区范围）检测发现：MT-TQ 基因中的 m.4333 和 m.4354 两个位点，在至少一组 L2R2 重复实验中出现>1% 的 C • G → T • A 替换（较 L2-only 对照组高 2 倍以上），提示可能存在 DdCBE-m.4291-L2R2 介导的近端旁观编辑。

但全基因组线粒体测序并未重复检测到这些特异性替换，暗示其可能是 NGS 前 PCR 扩增引入的假象。